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次氯酸鈣大腸桿菌殺滅率檢測技術規(guī)范與方法優(yōu)化研究

發(fā)布時間： 2025-09-30　　點擊次數： 54次

次氯酸鈣大腸桿菌殺滅率檢測技術規(guī)范與方法優(yōu)化研究
一、檢測原理與標準依據
（一）殺菌機制
次氯酸鈣溶于水釋放次氯酸（HClO），通過以下途徑殺滅大腸桿菌（Escherichia coli 8099）：
1.細胞膜破壞：HClO穿透細胞壁，氧化磷脂雙分子層；
2.蛋白質變性：與酶活性中心巰基（-SH）反應，抑制代謝酶活性；
3.DNA損傷：破壞核酸結構，阻止細胞復制1。
（二）標準方法
國標：GB/T 27952-2020《消毒劑衛(wèi)生要求》懸液定量殺滅試驗；
國際標準：EN 1276《化學消毒劑和防腐劑食品、工業(yè)、家庭和公共區(qū)域用化學消毒劑殺菌活性評價》2。
二、試驗材料與試劑配制
（一）菌株與培養(yǎng)基
1.標準菌株：大腸桿菌8099（CMCC(B) 44102），由中國普通微生物菌種保藏中心提供；
2.培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂（NA），pH 7.0±0.2，121℃滅菌20分鐘1。
（二）關鍵試劑
次氯酸鈣溶液：
母液：稱取0.5 g次氯酸鈣（有效氯65%），用無菌水溶解定容至100 mL，有效氯濃度3250 mg/L；
工作液：用PBS稀釋至500 mg/L（按殺滅要求調整）3。
中和劑：
0.1%硫代liu酸鈉（Na?S?O?）溶液，中和有效氯至＜0.1 mg/L1。
三、試驗流程與操作規(guī)范
（一）菌懸液制備
活化培養(yǎng)：
將凍干菌種接種至NA斜面，37℃培養(yǎng)18-24小時；
挑取單菌落轉接至營養(yǎng)肉湯，37℃振蕩培養(yǎng)6小時（對數生長期）。
稀釋與干擾物添加：
用0.03 mol/L PBS（含10%小牛血清）稀釋菌液至1×10? CFU/mL；
混勻后備用，2小時內使用2。
（二）殺滅試驗步驟
樣品處理：
取5 mL次氯酸鈣工作液（500 mg/L）至滅菌試管，37℃水浴預熱5分鐘；
加入5 mL菌懸液（1×10? CFU/mL），立即計時并混勻。
作用與終止：
20℃±1℃避光作用10分鐘（按產品說明書調整作用時間）；
取1.0 mL混合液至9.0 mL中和劑，混勻后靜置10分鐘1。
培養(yǎng)與計數：
取中和后液體1.0 mL，用PBS梯度稀釋（10?1-10?3）；
各稀釋度取0.5 mL傾注NA平板，37℃培養(yǎng)48小時，計數菌落數（CFU）2。
（三）對照組設置
對照組類型操作步驟作用
陽性對照組菌懸液+PBS（不加消毒劑）驗證菌活性
陰性對照組中和劑+培養(yǎng)基驗證無菌操作
中和劑對照組消毒劑+中和劑+菌懸液驗證中和劑有效性
四、結果計算與判定標準
（一）殺滅率計算
殺滅率（）
符號說明：
試驗組活菌數（CFU/mL）；
陽性對照組活菌數（CFU/mL）1。
（二）判定標準
產品類型作用時間（min）有效氯濃度（mg/L）殺滅率要求（%）
飲用水消毒劑 10 500≥99.9
物體表面消毒劑 5 800≥99.99
五、影響因素與優(yōu)化策略
（一）關鍵因素控制
因素優(yōu)化條件效果
有效氯濃度 500-1000 mg/L（根據有機物調整）殺滅率提升至99.99%
作用pH 6.5-7.5（中性條件） HClO占比達80%以上
溫度20-25℃ 溫度每升高10℃，殺滅時間縮短一半
（二）常見問題解決方案
問題現(xiàn)象原因分析解決措施
殺滅率偏低有效氯濃度不足或中和劑過量重新標定濃度，調整中和劑用量至9 mL
菌落蔓延菌懸液濃度過高增加稀釋梯度至10??
中和劑失效硫代liu酸鈉氧化使用新鮮配制的中和劑
六、質量控制與應用場景
（一）質控指標
1.菌懸液濃度：1×10?±0.5×10? CFU/mL；
2.中和劑有效性：中和后殘留菌數≤10 CFU/mL2。
（二）典型應用
1.飲用水消毒：驗證次氯酸鈣投加后大腸桿菌達標（≤0 CFU/100 mL）；
2.醫(yī)療環(huán)境表面：物體表面擦拭后殺滅率≥99.99%1。
關鍵詞：次氯酸鈣；大腸桿菌；殺滅率；懸液定量試驗；GB/T 27952
參考文獻
[1] GB/T 27952-2020 消毒劑衛(wèi)生要求[S].
[2] EN 1276 化學消毒劑殺菌活性評價[S].
[3] WHO 飲用水消毒指南[S].

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